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ELISA 样品制备

发布者: 欧洲杯投注     发布时间:2021-03-26     
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进行 ELISA 前制备样品的提示

请参阅随试剂盒提供的实验方案,了解有关样品制备和相容性样品类型的产品特定详细信息。

这些指南旨在作为教育资源用于制备 ELISA 测定法中用到的常规试样。根据靶标和需要检测内容的不同,样品的制备过程可以进行优化。当构建新的测定法时,查阅相关文献获得与您实验类似的实验实例通常是较好的做法。


样品制备方法


细胞培养物上清液

—将细胞培养基移至离心管,并在 4°C 下以 1,500 rpm 离心 10 分钟。

—立即分装上清液并在 -80°C 下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。

细胞提取物

—将组织培养板放置在冰上。

—吸出培养基并且用冰冷的 PBS 轻轻洗涤细胞一次。

—吸出 PBS 并且每 100 mm 培养板添加 0.5 mL 完全提取缓冲液。

—剥离细胞,收集在倾斜板中,然后移至预冷管中。

—短暂涡旋并在冰上孵育 15-30 分钟。—在 4°C 下以 13,000 rpm 离心 10 分钟,沉淀不溶性内容物。

—将上清液(这里是指可溶性细胞提取物)分装至冰上干净的冷却管,然后在 -80°C 下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。

条件培养基

—将细胞接种到完全(含血清)生长培养基中,使细胞增殖到所需覆盖度。

—弃去生长培养基并用几毫升温热 PBS 小心洗涤。重复洗涤步骤。

—弃去最后的 PBS 洗涤液并小心添加无血清生长培养基。

—孵育 1-2 天。—将培养基移至离心管,并在 4°C 下以 1,500 rpm 离心 10 分钟。

—立即分装上清液并在 -80°C 下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。

乳汁

—收集样品并在 4°C 下以 10,000 x g 离心 2 分钟。

—分装上清液并在 -80°C 下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。血浆—将全血收集到含抗凝血剂的管中或添加 0.1 M 柠檬酸钠至 1/10 终体积。

—在 4°C 下以 3,000 rpm 离心 10 分钟。

—立即分装上清液(血浆)并在 -80°C 下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。

尿液

—收集样品并在 4°C 下以 10,000 x g 离心 2 分钟。

—分装上清液并在 -80°C 下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。

唾液

—收集样品并在 4°C 下以 10,000 x g 离心 2 分钟。

—分装上清液并在 -80°C 下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。

血清

—将全血收集到未经处理的试管中,比如是不含抗凝血剂的试管。

—在室温下静止孵育 20 分钟。

—在 4°C 下以 3,000 rpm 离心 10 分钟。

—立即分装上清液(血清)并在 -80°C 下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。

组织提取物

—用干净的工具切割所关注的组织,最好在冰上进行,并应尽可能快以防止被蛋白酶降解。

—将组织置于圆底的微量离心管中,并浸入液氮中进行速冻。将样品保存在 -80°C 下以便后续使用或放置在冰上进行直接匀浆。

—对于约 5 mg 的一片组织,需要向管中添加约 300 μL 完全提取缓冲液(查看细胞/组织提取缓冲液配方),然后用电动匀浆器匀浆。—清洗刀片两次,每次清洗使用 300 μL 完全提取缓冲液,然后在 4°C 下维持恒定振动 2 小时(例如置于冷室中的回旋摇床上)。

—在 4°C 下以 13,000 rpm 离心 20 分钟。置于冰上,将上清液(这里是指可溶的蛋白质提取物)分装至新的冷却管中并在 -80°C 下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。


裂解缓冲液的体积必须根据存在的组织数量确定。最终蛋白质提取物的典型浓度 > 1 mg/mL。


细胞/组织提取缓冲液配方 

–100 mM Tris,pH 7.4 

–150 mM NaCl 

–1 mM EGTA 

–1 mM EDTA 

–1% Triton X-100 

–0.5% 脱氧胆酸钠


制备完全提取缓冲液所需的其它试剂。

—磷酸酶抑制剂混合物—蛋白酶抑制剂混合物 

–PMSF


在使用前才根据生产商的说明来添加磷酸酶和蛋白酶抑制剂的混合物到细胞提取缓冲液里面,PMSF 的终浓度为 1mM。


一般建议

—推荐的蛋白质提取物浓度为至少 1-2 mg/mL。

—通常,用结合缓冲液将血清、血浆、细胞和组织提取物稀释 50%。

—在融化后使用前,将样品在 4°C 下以 10,000 rpm 离心 5 分钟以除去任何沉淀物。

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